超敏ELISA产品通讯：

酪胺信号放大技术在ELISA方面的应用

――达科为ELISA超敏试剂盒

酪胺信号放大技术（tyramide signal amplification,TSA）是上世纪90年代在传统酶促放大理论基础上发展起来一种新的信号放大技术。其基本原理如下：在过氧化氢存在时，一些酶如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等可以催化一种酪胺的底物为一种非常活跃的短寿命中间体；在短时间内，中间体可以共价结合到周围蛋白的富电子表面形成酪胺化复合物，大量富集成以酶为中心的类似“岛”或者“树”状的聚集团（如图）；可以在酪胺上标记荧光或者其它标记物如生物素用于检测。

酪胺信号放大技术不是检测技术，只是放大系统，它可以提高ELISA、IHC和ISH等的灵敏度10-100倍。另外，TSA作为扩大信号其理论本身不会增加非特异性信号，而不是像原位PCR那样扩增检测目标，所以不会造成检测偏差和假阳性。

但是，若靶标本底生物素水平较高或者抗体交叉反应比较高，同样实验背景会成倍地放大。TSA导致新问题需要采用产生更低背景的实验材料或方法，来降低检测技术的非特异性背景，为TSA放大系统提供足够的空间。如在分子杂交中使用DNP标记的TSA Plus，由于DNP是生物体内罕见的分子，检测背景很低，性噪比就高。

TSA应用范围广泛，ELISA, 免疫组化（IHC），原位杂交（ISH），芯片检测和其它任何使用HRP或AP的检测方法中都可以应用，它的放大效应可以使ELISA双抗体夹心法检测样品浓度从皮克级（10^－12）别提高到飞克级别（10^－15）。

TSA应用在传统ELISA上开发出超敏ELISA，这使检测人体内飞克级别的细胞因子成为可能，有利地促进科学深入研究人体内微量蛋白的作用。超敏ELISA还可以间接节省客户研究所用的宝贵样品，客户在有限的样本中检测更多蛋白指标。

基于TSA技术开发的ELISA超敏试剂盒，其TSA放大步骤如下:  

1. 在传统ELISA基础上，HRP结合到微孔板后，再加入放大物质A（ biotinyl-tyramide ,B-T）到孔内，孵育20分钟。
2. 洗涤4次。
3. 加入streptavidin-HRP(SA-HRP)，结合 B-T。 孵育20min。
4. 洗涤4次。
5. 加入TMB显色10-15分钟，中止反应，在450nm波长读数。

以人IL-6 ELISA产品为例，超敏试剂盒与普通试剂盒实验对比图表如下：

放大倍数50       酶： HRP         显色底物：TMB          检测波长：450nm         

检测范围

4 - 0.125 pg/ml

 灵敏度

0.04pg/ml

人IL-6 ELISA超敏试剂盒同类产品比较如下：

       人IL-6 ELISA超敏试剂盒性能对比分析发现，DKW公司与另外四家公司超敏试剂盒在规格、检测范围、灵敏度和变异系数方面没有显著差别；在实验操作的孵育时间上，DKW公司超敏试剂盒的孵育时间只有120分钟，远远小于其它四家公司的孵育时间。